₂HPO₄ 0.3%、培养温度为30℃、初始pH值为7.5、接种量为4%、装瓶量为30%、发酵时间为120 h。优化后的发酵培养基和培养条件有利于抑菌活性物质的合成。利用优化培养基大量发酵Bacillus sp.7PJ-16,收获菌悬液和发酵上清液,检测其对病原菌生长和桑园土壤微生态的影响。结果显示,7PJ-16菌悬液和发酵上清液均可明显抑制菌核萌发、菌丝生长、子实体生长发育以及孢子活力等菌核病原菌生长过程;与清水对照相比,经生防菌处理的桑园土壤中放线菌门的细菌比例显著升高,厚壁菌门中芽孢杆菌属的丰度亦有上升趋势,且β多样性分析结果显示,接种生防菌的土壤菌群结构更加稳定。连续两年的田间生防实验结果表明,不同浓度菌悬液和不同稀释倍数发酵上清液均能不同程度防控桑椹菌核病的发生,其中施用3次1.0×10⁹ CFU/mL菌悬液处理组的田间防效最高（90.84%）,其防效甚至稍优于化学农药处理组（90.52%）,且该处理组对桑果的生长具有一定的催熟作用。温室浸种和盆栽实验结果显示,不同浓度菌悬液和不同稀释倍数发酵上清液对桑种萌芽和桑幼苗生长的影响差异较大,其中1.0×10⁶CFU/mL的菌悬液和100倍稀释的发酵上清液能显著提升桑种发芽势和发芽率,且其对桑幼苗生长的各项指标均能起到促进作用。3.内生芽孢杆菌7PJ-16防病促生作用的分子机制研究Bacillus sp.7PJ-16菌株全基因组测序分析结果显示,该菌株基因组是由一条大小4.2 M的环形染色体以及两个内生质粒构成。基于芽孢杆菌近缘物种系统进化树分析,将前期鉴定为特基拉芽孢杆菌的7PJ-16菌株重新鉴定为枯草芽孢杆菌,更名为B.subtilis 7PJ-16。基因功能注释和次生代谢产物预测结果显示,7PJ-16菌株基因组中包含6个与抑菌物质合成相关的基因簇以及19个与促生物质合成相关的基因,这些基因与表面活性素、丰原素、铁载体、吲哚乙酸等生防相关代谢物的生物合成有关,同时该菌株基因组中亦发现21个与侵染定植过程（生物膜形成、运动性）相关的基因。为进一步挖掘生防相关基因及阐明B.subtilis 7PJ-16菌株与菌核病原菌（Sclerotinia sclerotiorum PZ-2、Scleromitrula shiraiana SXSG-5）之间的互作过程,本研究采用转录组测序技术,对共培养过程中的生防细菌与病原真菌分别进行原核和真核转录组分析。通过分析原核转录组数据发现,病原菌生长导致拮抗细菌的鞭毛组装和驱性相关基因下调表达,但其诱导了丰原素、铁载体、溶杆菌素等多种生防代谢物合成相关基因的上调表达;在真核转录组中,经拮抗细菌生物胁迫后,病原真菌的抗氧化酶相关基因多数表达上调,而其细胞壁组分合成（e.g.,几丁质）、植物胞壁降解酶代谢（e.g.,果胶酶、纤维素酶）、黑色素合成等与致病力相关的基因显著表达下调。基于7PJ-16菌株组学研究中挖掘到的大量生防相关基因,本研究从该菌株基因组中成功筛选和克隆到13个关键生防基因,其中包含5个表面活性素合成相关的基因（srfAA、srfAB、srfAC、srfAD、sfp）、7个溶杆菌素合成相关的基因（bacA、bacB、bacC、bacD、bacE、bacF、bacG）以及1个丰原素合成相关的基因（fenE）;利用同源重组技术,成功敲除与丰原素（fenE）和溶杆菌素（bacG）合成相关的两个生防基因,获得稳定转化子?FenE和?BacG,敲除株生物膜形成能力和抑菌活性均有不同程度的降低。4.内生芽孢杆菌7PJ-16生防相关代谢物的分析与鉴定结合生防相关基因的分析与功能验证,为进一步揭示B.subtilis 7PJ-16产生的生防相关代谢物,本研究首先检测了其活性发酵上清液中代谢产物的理化性质。结果显示,该活性发酵上清液对高温、酸碱具有较好的耐受性,对α-糜蛋白酶、胰蛋白酶不敏感,而对胃蛋白酶、蛋白酶K敏感。基于活性代谢物的理化性质,设计纯化策略,通过追踪抑菌活性,采用萃取、硅胶柱层析、薄层层析（TLC）、高效液相色谱（HPLC）等分离手段,从7PJ-16活性发酵上清液中分离纯化获得环二肽cycle（Pro-Phe）等6个单体III小分子物质;并利用酸沉淀与甲醇抽提相结合的方法,从7PJ-16发酵液中获得具有强烈抑菌活性的脂肽粗提物,经HPLC半制备分离后,质谱鉴定结果表明,该活性组分中包含表面活性素和丰原素两种脂肽抗生素,这与前文功能基因分析验证的结果一致。此外,7PJ-16菌株还可产生铁载体、植物外源激素吲哚乙酸和赤霉素等促生相关物质。综上所述,本研究从基因组、转录组、基因功能的分析验证及代谢物等层面,明确了拮抗作用与促生作用是桑树内生B.subtilis 7PJ-16对桑椹菌核病具有生防作用的主要机制。该菌株安全性能高,定植能力强,可通过产生表面活性素、丰原素、二肽小分子物质（环二肽和溶杆菌素）等多种抗生素来抑制桑椹菌核病原菌生长,进而在田间成功防控菌核病的发生与危害,且该菌株可通过产生植物激素、铁载体等促进桑种萌发和桑幼苗生长,从而来提升宿主系统抗性间接减少病害发生。论文研究取得的相关结果为桑椹菌核病生物防治奠定理论依据和实验基础,亦可为其他植物病害的生物防治提供重要参考。

文章来源：《广东蚕业》 网址: http://www.gdcyzz.cn/qikandaodu/2021/1110/1661.html